pCold-SUMO 原核蛋白表達(dá)試劑盒

原核蛋白表達(dá)試劑盒簡(jiǎn)介       【*  4000/盒     】

         本試劑盒所包含的原核表達(dá)載體（pCold-SUMO）是在pCold載體基礎(chǔ)上改造而成（Solarbio ），該載體啟動(dòng)子（CS Promoter）來源于南極嗜冷細(xì)菌

，在低溫下（15度）才能啟動(dòng)蛋白的表達(dá)。低溫下細(xì)菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提

高了蛋白可溶性表達(dá)，增強(qiáng)了活性蛋白的表達(dá)比率。該表達(dá)系統(tǒng)所包含的SUMO tag可以極大地提高小分子量蛋白的表達(dá)量，而且進(jìn)一步提

高了蛋白的可溶表達(dá)幾率。同時(shí)，試劑盒配備的SUMO Protease（含6×His標(biāo)簽）可特異性去除SUMO tag，從而得到不含任何標(biāo)簽的重組蛋白。

原核蛋白表達(dá)試劑盒操作方法

       I. 重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.根據(jù)目的基因選擇合適的酶切位點(diǎn)，將pCold-SUMO載體和插入片段分別進(jìn)行雙酶切

2.酶切完成后 經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，將線性載體進(jìn)行凝膠回收（Solarbio, D1200） 。

3.連接反應(yīng)（以SolarbioT4連接酶為例）

4.取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入*0 感受態(tài)細(xì)胞（Solrbio ,C1200） ，通過測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。

II. 重組蛋白表達(dá)

1. 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌ArcticExpress或BL21（DE3）、BL21（DE3）plys、Origami等感受態(tài)細(xì)胞）。

2. 挑選生長良好的菌落，接入LB培養(yǎng)基（含40-100ug/ml氨芐青霉素），37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.2-0.6。

4. 待培養(yǎng)基冷卻至15℃后，再靜置30min。

5. 加入適量IPTG（0.1-1 mM）,15℃振蕩培養(yǎng)24h。

6. 4,000 rpm室溫離心15min，收集細(xì)胞。

7. 用重懸液重懸細(xì)胞（含PMSF或Protease Inhibitor Cocktail），并置于冰上破碎。

8. 破碎后使用SDS-PAGE膠檢測(cè)蛋白的表達(dá)及可溶性表達(dá)情況。

III. 蛋白純化

1.融合SUOM標(biāo)簽的重組蛋白含有6×His標(biāo)簽，重組蛋白可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401）進(jìn)行純化。詳細(xì)的純化操作步驟請(qǐng)參考Solrbio Ni-NTA

Resin（Solarbio ，C0401）說明書。

2.SUMO標(biāo)簽分子量為15KD。融合SUOM標(biāo)簽的重組蛋白可通過SUMO Protease切割去處SUMO標(biāo)簽，SUMO Protease切割位點(diǎn)見圖譜。切割后

SUMO標(biāo)簽含6×His標(biāo)簽、目的蛋白不含有6×His標(biāo)簽，所以可通過Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401） 將SUMO標(biāo)簽和未*切割的融合蛋白

與不含SUMO標(biāo)簽的目的蛋白分離純化。

3.本SUMO Protease蛋白分子量為31KD,并含有6×His標(biāo)簽可通過Ni-NTA Resin去除。

注意：對(duì)于大部分融合蛋白，SUMO Protease的理想反應(yīng)液中的NaCl濃度為150mM。然而，根據(jù)實(shí)際情況可在100 mM～300 mM之間調(diào)節(jié)NaCl

的濃度以達(dá)到佳效果。若蛋白為熱不穩(wěn)定性，請(qǐng)?jiān)?°C孵育較長時(shí)間或增加酶的用量。

（2）. 混勻上述體系后于30°C 孵育，在1、2、4、6小時(shí)分別吸出30 μl上述反應(yīng)液，分別置于EP管中。

（3）. 向上述EP管中加入6 μl 5XSDS Loading Buffer，置于-20°C。

（4）. 取30 μl樣品進(jìn)行SDA-PAGE 分析。

原核蛋白表達(dá)試劑盒